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细胞低血清驯化技术

日期:2019-05-24 15:45
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摘要:BHK21细胞和Vero细胞可以使用低血清培养基进行细胞的培养,通常细胞需要进行低血清驯化过程。对于细胞低血清驯化一般有两种方法,直接适应和间接适应。直接适应是指弃去原细胞培养液,直接使用低血清培养基添加低浓度血清培养,操作简单,但由于直接适应细胞生长环境变化较为明显,驯化过程中需注意的事项较多,而且细胞驯化的效果与细胞的特性有很大关系;间接适应一种方法是使用原培养液和低血清培养液混合使用,在传代的过程中逐渐增大低血清培养液的比例,另一种方法是使用低血清培养基添加常规血清量培养细胞,在传代过程中逐渐降低血清的使用量,该适应方法虽然繁琐,但通常细胞驯化效果较好。BHK21细胞即可使用直接适应法驯化,也可使用间接适应法进行驯化。Vero细胞通常使用直接适应法进行细胞驯化。

细胞低血清驯化技术

细胞低血清驯化的理论基础

根据培养物的不同,细胞培养可分为原代培养(包括从组织块开始的原代培养和从细胞悬液开始的原代培养)和传代培养两大类。通过各种传代培养的方法,可以得到各种细胞系、细胞株,克隆等细胞的传代培养物。据国际组织培养学会专业术语委员会规定,原代培养物在首次传代后即成为细胞系,在一个细胞系中,由于细胞来自原代培养物中的不同的细胞谱系,并非所有的细胞均具有相同的分化标志和特性。通过克隆形成法或各种选择培养法,有可能从原代培养物或细胞系中把那些具有共同特性或分化标志的细胞群体分离出来,形成细胞株。细胞克隆是单个细胞通过有丝分裂所形成的细胞群体,是细胞株的特殊情形。一个克隆中的细胞在遗传性上不一定是均质的,如肿瘤细胞的克隆由于不均质分裂在遗传性上就是不均质的。由此可见,有组织分离的原代细胞培养物,经传代为细胞系以及细胞株,培养物中的细胞基因会发生改变,即细胞培养物随培养过程发生的基因变异性。另外,不管细胞系还是细胞株,甚至细胞克隆,细胞群体中的细胞基因并非是一致的,即存在细胞培养物的非均质性现象。这些为细胞培养的适应、筛选、驯化提供了理论基础。
BHK21细胞和Vero细胞,做为来源于正常细胞转化的传代细胞系,同样也存在群体细胞的非均质现象。由于不同的培养条件或传代的过程不同,BHK21细胞和Vero细胞会形成培养特性的差异。因此,在不同的企业或实验室,经常可见到细胞形态、细胞贴壁性、细胞生长特性等方面存在差异的BHK21细胞和Vero细胞。正是由于BHK21细胞传代过程的非均质性,使用降低血清含量的方法进行细胞的传代培养,可得到适应于低血清培养的BHK21细胞培养物。
体外培养的细胞形态,概括说来可分为两类,一类是以上皮细胞或类上皮细胞为代表的器官专一细胞(即器官实质细胞),一类是以成纤维细胞或成纤维样细胞为代表的间叶细胞。典型的体外上皮细胞在光学显微镜下为正方形或六角形,细胞紧密相连长成一片,核质比值较高。可区分为正常上皮细胞和肿瘤上皮细胞两种。绝大部分体外上皮细胞只能在原代培养物中存活很短一段时间,不能传代。少数体外上皮细胞可以因为条件适合传代下去,甚至形成一个连续的细胞株系。迄今为止,形成连续系的细胞几乎都是肿瘤上皮细胞。典型的成纤维细胞在光学显微镜下呈细长形或梭形,细胞较为疏松地长成一片,或平行成束,或交叉成网,其形态可因培养基及细胞密度的不同而不同。某些类型的成纤维样细胞可以分泌胶原、透明质酸和硫酸软骨素等。一般说来,成纤维细胞在体外生存的期限虽比正常上皮长一些,但亦极为有限。在少数情况下,生长渐趋停止的成纤维样细胞,在一定时期之后,可突然又重趋活跃,并不断增殖为可以连续传代的细胞系,其细胞可以在体内形成肿瘤,此种现象称为自发新生性转化,多见于啮齿动物的成纤维细胞,尤多见于小鼠的成纤维样细胞。在BHK21细胞和Vero细胞低血清培养过程中,由于血清含量的降低,以及细胞培养条件的改变,与传统的高含量血清培养比较,细胞的形态会发生或多或少的改变,这是正常现象,不影响细胞的低血清传代效果。


 BHK21细胞和Vero细胞的低血清驯化
BHK21细胞和Vero细胞可以使用低血清培养基进行细胞的培养,通常细胞需要进行低血清驯化过程。对于细胞低血清驯化一般有两种方法,直接适应和间接适应。直接适应是指弃去原细胞培养液,直接使用低血清培养基添加低浓度血清培养,操作简单,但由于直接适应细胞生长环境变化较为明显,驯化过程中需注意的事项较多,而且细胞驯化的效果与细胞的特性有很大关系;间接适应一种方法是使用原培养液和低血清培养液混合使用,在传代的过程中逐渐增大低血清培养液的比例,另一种方法是使用低血清培养基添加常规血清量培养细胞,在传代过程中逐渐降低血清的使用量,该适应方法虽然繁琐,但通常细胞驯化效果较好。BHK21细胞即可使用直接适应法驯化,也可使用间接适应法进行驯化。Vero细胞通常使用直接适应法进行细胞驯化。
BHK21细胞细胞驯化的效果与使用的BHK21细胞株有很大的关系,有些BHK21细胞很容易驯化,而另一些BHK21细胞则驯化比较困难,另外,细胞驯化时的状态与活力、细胞致密度、细胞代次、细胞消化程度等均对细胞驯化有影响。 Vero细胞与BHK21细胞相比,更容易进行细胞的低血清驯化。
进行细胞驯化时,应挑选形态良好、生长旺盛、形成良好单层的细胞作为驯化对象,这样的细胞由于正处于对数生长期,细胞活力强,贴壁性好,对血清含量的降低更具有耐受性,有利于细胞驯化的顺利进行。细胞驯化过程中,控制细胞良好的贴壁十分重要,由于细胞在静止培养时更容易贴壁,所以*初的细胞驯化时应当在方瓶中进行,而不建议直接用转瓶进行驯化,但Vero细胞也可直接使用转瓶进行细胞驯化。


细胞低血清驯化程序
Ø 弃原培养液,换新鲜低血清培养基添加10%血清培养,待细胞成致密单层后,使用含10%血清的低血清培养基传代培养;
Ø 待细胞成良好致密单层时,对细胞进行传代,降低血清使用量至5-8%,使用该浓度血清连续传代2-3次,然后继续降低血清使用量;
Ø 待细胞生长增殖、贴壁率等与使用高浓度血清培养效果无显著差异时,继续传代,降低血清浓度至3%;
Ø 一般使用3%血清血清培养基培养3-4代,细胞即可适应低血清培养,当细胞生长增殖速率与高浓度血清培养时效果基本相当时,即可认为细胞驯化完成;
Ø 扩增驯化适应低血清培养的细胞,使用含10%DMSO和20%血清的低血清培养基冻存细胞建库,驯化完成的细胞复苏时即可使用3-5%血清的低血清培养基进行培养,经2-3代培养细胞生长增殖速率恢复至冻存前水平。

BHK21细胞低血清驯化效果
本实验室采用分阶段驯化法驯化BHK21细胞,适应 MD611低血清培养基,经5~6代后细胞逐渐适应,并建立低血清BHK21细胞种子库。已适应MD611的BHK21细胞在血清含量大于2%的情况下均能稳定传代。使用MD611培养基,在T25细胞培养瓶中,低血清(3%血清含量)培养该低血清适应细胞,细胞轮廓清晰并具有较强立体感,形态良好,细胞生长旺盛,可以大分种比例进行细胞传代培养。以1:10分种比例进行细胞传代培养,接种培养4小时,细胞开始贴壁伸展;培养18小时,细胞进入快速生长期;培养24小时,生长为单层细胞;培养48小时,细胞生长为致密单层。
3.4-1.jpg3.4-2.jpg
BHK21细胞培养4小时                                     BHK21细胞培养18小时

3.4-3.jpg3.4-4.jpg
BHK21细胞培养24小时                                       BHK21细胞培养48小时

 
中农威特生物技术股份有限公司的刘学荣等人,使用T25细胞培养瓶对BHK21细胞进行了低血清适应研究,使用含10%小牛血清的MEM和乳汉液混合培养液做为试验对照。试验分两个步骤进行,首先在5%血清用量的情况下逐步将BHK21细胞适应低血清培养基,直到细胞完全适应,之后在此基础上,使用低血清培养基分阶段逐渐降低血清的用量,将 BHK21细胞适应于低血清培养环境,当细胞完全适应低血清培养后,冻存细胞建立生产用细胞种子库。在**个步骤的试验过程中,替换培养基的初期细胞也有不适应的表现。与对照组相比,细胞的生长延迟期明显变长;细胞活性由 90%降到40%。细胞还可能出现大量死亡,不能继续传代等异常现象。但在维持5、6代后,细胞逐渐恢复正常。

 

BHK21 细胞适应MD611的生长情况

培养基

201 培养基

50 % 201 + 50 % 611

25 % 201 + 75 % 611

MD 611

小转瓶

大方瓶

小转瓶

大方瓶

小转瓶

大方瓶

小转瓶

大方瓶

新生牛血清

10%

10%

5%

5%

5%

5%

5%

5%

分种比例

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

1:5

pH (接种时)

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

贴壁比例

24h

50%~60 %

50%~60 %

60%~70 %

60%~70 %

60%~70 %

60% ~70 %

60%~70 %

60%~70 %

48h

90%

90%

100%

100%

100%

100%

100%

100%

72h

100%

100%

大多数细胞开始老化,表面有大量死细胞

96h

变圆,开始脱落

表面死细胞较多,但未脱落

长成单层时间

72h

72h

48h

48h

48h

48h

48h

48h

细胞数量(108)

0.8~0.9

4~5

0.8~0.9

4~5

0.6~0.7

3~4

0.6~0.7

3~4

试验的第二个步骤,将BHK21细胞依次使用5%、4 %、3%、2%、1 %的血清进行适应培养,试验标明降血清过程中,*初的3代细胞没有表现出不适应现象,但在继续传代的过程中发现,添加 2%以下血清量的细胞,活性显著下降、贴壁性差、比生长率降低,很难继续传代。因此,选择4%血清培养的细胞培养条件,筛选出传代稳定性好、生长较快的细胞适应株,并能连续传30代。

BHK21 细胞适应低血清培养的生长情况

培养基

201 培养基+10%血清

MD611

+5%血清

MD611+4%血清

MD611+3%血清

MD611+2%血清

MD611

+1%血清

分种比例

1:4

1:4

1:4

1:4

1:4

1:3

pH (接种时)

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

7.2

贴壁比例

24h

60% ~ 70 %

60%~70 %

60%~70 %

60%~70 %

60%~ 70 %

40%~ 50 %

48h

100%

100%

100%

100%

100%

70%~80 %

72h

大多数细胞开始老化,表面有大量死细胞

100 %

96h

细胞开始变圆,开始脱落

细胞数量(107)

2

2.3~2.5

2.1~2.3

2~2.2

1.9~2.1

1.6~1.8

细胞活性

92% ~95 %

92%~95 %

92%~95 %

92%~95 %

92%~95 %

92%~95 %

连续传代次数

30

30

30

30

30

10

刘学荣等对低血清适应的BHK21细胞进行了进一步的试验研究和分析。使用MD611培养基对112代BHK21细胞,进行低血清驯化适应,之后继续用低血清培养基连续传代30代以上,将该细胞按为1:5分种比例进行细胞传代,以传统培养基加10%小牛血清培养的细胞为对照组。试验组的血清含量分别为5%、4%、3%、2%和1%。其中血清含量为5%的记为Ⅰ组,血清含量为4%的记为Ⅱ组,以此类推,共计五组。试验结果见下表。

不同血清浓度培养时细胞的生长情况(×107

组别

对照组

细胞接种量

0.462

0.42

0.415

0.403

0.387

0.352

细胞数量(24h)

0.83

0.85

0.764

0.752

0.68

0.62

细胞数量(48h)

1.86

2.42

2.36

2.28

1.84

1.26

细胞数量(72h)

2.51

1.98

2.12

2.04

2.20

1.73

细胞数量(96h)

2.21

1.85

1.87

1.92

1.86

1.65


不同血清浓度对细胞比生长率的影响

组别

对照组

0-24h

0.80

1.02

0.84

0.87

0.76

0.76

24-48h

1.24

1.85

2.09

2.03

1.71

1.03

48-72h

0.35

-0.18

-0.1

-0.11

0.20

0.37

72-96h

-0.12

-0.07

-0.12

-0.06

-0.15

-0.05

不同血清浓度对细胞活性的影响

组别

对照组

24h

95.4%

96.3%

94.6%

97.1%

95.3%

94.5%

48h

96.2%

96.6%

95.2%

95.3%

97.5%

96.2%

72h

93.6%

90.4%

93.6%

94.0%

94.6%

95.5%

96h

88.2%

87.5%

90.4%

89.2%

86.2%

89.4%

试验结果显示,已适应MD611培养基BHK21细胞,在血清含量大于2%的情况下均能稳定传代,并可连续传代均在30代以上,能够满足生产实际需要。添加5%4%3%血清的试验组细胞均在48h达到*大量,细胞产量、细胞活性与对照组差异不大;添加2%1%血清的试验组在72h达到*大量,细胞产量略低于对照组。但当细胞数量达到*大值后,试验组的细胞开始老化,大量细胞悬浮于培养液中,致使细胞数量减少较快,细胞活性也逐渐降低。BHK21细胞在24-48h生长较快,平均比生长率在1.74d-1以上,高于对照组。

 Vero细胞低血清驯化效果
为了研究血清含量对MD504低血清培养Vero细胞的影响,在T25细胞培养瓶中,我们采用MD504培养基对同一批Vero细胞进行培养,分种比例1:6,血清添加量分别是10%、5%和3%。结果表明,与添加10%NBS的培养基相比,添加5%和3%的细胞轮廓清晰,形态正常,细胞生长旺盛,在早期(24小时以前)细胞生长速度略慢于10%,培养48~72小时,细胞生长为致密单层,细胞密度可达6~7×106 cell/瓶,与添加10%NBS的没有明显区别。

3.5-1.jpg3.5-2.jpg

左图:Vero细胞(T25培养瓶),培养48小时,培养液为含10%血清的MD504培养基
右图:Vero细胞(T25培养瓶),培养48小时,培养液为含5%血清的MD504培养基

3.5-3.jpg  

左图:Vero细胞(T25培养瓶),培养48小时,培养液为含3%血清的MD504培养基

同时我们研究了MD504培养基与普通199培养基的使用效果,使用T25方瓶对Vero分种培养,培养结果显示,与普通199培养基相比,MD504培养的Vero细胞轮廓清晰,生长速度快,48小时形成致密单层,细胞密度达7~8×106 cell/

3.5-4.jpg     3.5-5.jpg

左图:Vero细胞(T25培养瓶),培养48小时,培养液为含5%血清的MD504培养基
右图:Vero细胞(T25培养瓶),培养48小时,培养液为含5%血清的199培养基对照


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